Trần Thanh Khâm sinh ngày 10 tháng 3 năm 1902[4] (có nguồn tin cho rằng ngày 2 tháng 3 năm 1902)[2] tại họ đạo Búng, xã Hưng Định, Lái Thiêu, Thủ Dầu Một (nay thuộc phường Hưng Định, thành phố Thuận An, tỉnh Bình Dương). Sau quá trình tu học dài hạn, ông được thụ phong linh mục ngày 5 tháng 4 năm 1930 tại Sài Gòn, khi mới 28 tuổi. Trong khoảng thời gian sau khi được phong chức linh mục, tân linh mục Khâm được giám mục giáo phận điều đi làm linh mục phó giáo xứ Chợ Lách (tỉnh Bến Tre). Một năm sau đó, linh mục Khâm được thuyên chuyển làm linh mục phó giáo xứ Cái Nhum (Bến Tre) trong vòng năm năm. Từ năm 1936 đến năm 1938, ông đảm nhận chức vụ linh mục chánh xứ Giáo xứ Xuân Hiệp, kiêm Quản họ Hiếu Nhơn (tỉnh Vĩnh long).[4]

Từ năm 1945 đến năm 1946, Trần Thanh Khâm đảm nhận vai trò linh mục quản nhiệm người Việt đầu tiên của giáo họ đạo Lạc Đạo. (nay là Nhà thờ chính tòa Phan Thiết). Sau đó, từ năm 1947 đến năm 1948, ông đảm trách vai trò linh mục Chánh xứ Giáo xứ Tầm Hưng (Phan Thiết).[4]

Chỉ một thời gian ngắn sau khi thuyên chuyển đến Tầm Hưng, năm 1950, ông được chọn làm linh mục Chánh xứ Giáo xứ Thủ Thiêm và giữ chức vụ này đến năm 1953. Sau đó, ông được thuyên chuyển làm linh mục Chánh xứ Giáo xứ Chợ Quán và giữ chức vụ này đến năm 1961. Song song với nhiệm vụ Chánh xứ Giáo xứ Chợ Quán, từ năm 1958 đến năm 1961, linh mục Khâm còn là linh mục Quản nhiệm họ đạo Hưng Phú. Năm 1960, linh mục Phanxicô Xaviê Trần Thanh Khâm xây dựng nhà nguyện họ Bình Xuyên, họ nhánh của Chợ Quán. Số giáo dân ban đầu là 800 người.[4]

Năm 1961, Tổng giám mục Phaolô Nguyễn Văn Bình bổ nhiệm Trần Thanh Khâm giữ chức Tổng Đại diện Tổng giáo phận Sài Gòn.[4]